【Nat Biotechnol】一种增加T细胞活性的新型CAR-E

近期，一篇名为《A CAR enhancer increase the activity and persistence of CAR-T cells》的文章发表在Nature Biotechnology上，作者Rakhshandehroo主要使用B 细胞成熟抗原（BCMA）融合低亲和力白细胞介素2（IL-2）组成CAR-E，选择性地结合CAR- T细胞，增加CAR- T细胞的增殖、肿瘤细胞的清除和记忆性CAR- T细胞的发育功能，并揭示了CAR和IL-2受体胞内结构域参与CAR- E的作用机制。

嵌合抗原受体（CAR） T细胞疗法作为一种单独或与联合的治疗方法用于各种实体肿瘤、血液系统恶性肿瘤和自身免疫性疾病的广泛研究。BCMA优先表达于成熟的B淋巴细胞，在造血干细胞或非造血组织中表达量极少，是多发性骨髓瘤恶性浆细胞的重要标记物。BCMA CAR-T细胞在重度多发性骨髓瘤患者中总有效率为80%，但CAR-T细胞在体内的持续时间仍然是治疗中严峻的挑战。

IL-2R由α、β、γ三个亚基组成，其中IL-2Rβ和共同的γ链（IL-2Rγ）共同形成信号二聚体，并以中等亲和力结合IL-2。而IL-2Rα（CD25）本身不发出信号，但它能增加IL-2对二元（βγ）IL-2受体的亲和力，使T细胞对低浓度的IL-2更为敏感。IL-2的活性依赖于移植细胞和携带天然IL-2受体内源性T细胞亚群的激活之间的平衡，以及引起剂量限制性毒性的宿主反应。为了克服这些限制，前人基于受体-配体正交化技术，将IL-2的特异性重新定向到过继转移的T细胞。使用突变的IL-2细胞因子和突变的IL-2受体特异性地相互结合，而不是与其野生型对应物结合。这样的策略可以更精确地控制IL-2的免疫激活作用，减少对其他细胞的影响，从而可能降低毒性并提高治疗效果。但是这种方式需要在CAR-T细胞上进行额外的基因编辑，这就会导致复杂的设计和操作技术，以及潜在的免疫原性和DNA突变的风险。为了克服这些限制而不引入额外的基因修饰CAR- T细胞，作者开发了基于抗原的CAR- E增强子。将靶抗原（例如BCMA）与低亲和力增强子分子（例如IL-2）融合，允许精确靶向CAR-T细胞，并促进输注后免疫调节剂的优先递送。

BCMA-CAR-E结构：作者构建了一个人BCMA蛋白外结构域与低亲和突变体人IL-2二聚体（简称“mutIL-2”）融合成的融合蛋白。这降低了其与人IL-2Rβ（CD25）的亲和力和与IL-2Rα（CD122）的亲和力（图1a）。因此，BCMA-mutIL-2融合蛋白通过抗原-CAR特异性结合，优先将低亲和力的IL-2分子输送到CAR T细胞的表面，从而最小化对正常T细胞、调节性T细胞或系统性毒性的影响。为了改善药代动力学并提高稳定性，作者在抗原和mutIL-2分子之间引入了人免疫球蛋白G1（IgG1）的CH3域（大小约为14 kDa）（图1a）。

为了测定BCMA–CH3–mutIL-2的结合亲和力，作者使用流式细胞术对不同浓度的BCMA CAR-E和BCMA CAR T细胞进行染色，结果发现CAR-E 与 CAR T 细胞的结合主要由 BCMA 驱动，并且 mutIL-2 分子与 CAR T 细胞和未转导的 T 细胞的结合均较弱。BCMA–mutIL-2 CAR-E 与人外周血单个核细胞（PBMC）中的任何免疫细胞群均未表现出结合（1b）。

随后，作者通过对T细胞激活标志物CD69的检测，评估了 BCMA CAR-E 对 BCMA CAR T 细胞的功能效应，发现BCMA CAR-E 处理CAR-T细胞会导致 CD69 表达显著增加（图1c），但未转导的T细胞未增加（图1d）。将BCMA CAR-T和BCMA CAR-E与OPM2细胞共培养后使用PI染色分析发现，在40小时内BCMA CAR-E不会抑制BCMA CAR-T的杀伤活性（图1e）。对 STAT5 活性的分析发现，BCMA CAR-E 通过顺式传递低亲和力的 IL-2 对靶向的 CAR T 细胞发挥作用，其中效应通过抗原-CAR结合介导（图1f）。

图1 BCMA CAR-E3的设计与开发

作者将OPM2植入NSG小鼠，建立了多发性骨髓瘤异种移植的小鼠模型，2周后注射CAR-T细胞，其中一组同时接受BCMA-CAR-E治疗，与未治疗动物相比，接受BCMA-CAR-E治疗组的脾脏和骨髓中CAR-T显著存在（图2c），一个月后进行流式分析BCMA和hCD45发现与对照组相比，双治疗组（BCMA-CAR-E和BCMA CAR-T治疗组）细胞具有明显的扩增和持久性。此外，通过对绿色荧光蛋白（GFP）阳性的OPM2细胞进行的脾脏和骨髓的流式细胞术分析显示，一些动物已经完全消除了肿瘤细胞，CAR- e治疗不仅增强了CAR- T细胞的持久性，而且还改善了肿瘤细胞的清除。

图2 BCMA CAR-E可增强CAR- T细胞的体内持久性

在这一部分，作者减少CAR-T的细胞数量，结果发现所有接受BCMA-mutIL-2 CAR-E治疗的小鼠（n=5）都实现了完全的肿瘤清除，而接受仅CAR T细胞（n=4）或CAR T细胞与VHH-mutIL-2联合治疗（n=4）的对照组小鼠均未能消除肿瘤（图3b,c）。收集的血液样本在不同时间点进行分析，结果显示，CAR-E治疗后，CAR T细胞在血液中出现了显著的扩增（图3d）。此外，治疗促进了多种记忆CAR T细胞的产生（图3e）。根据临床观察和体重测量，接受CAR-E治疗的小鼠未出现任何毒性症状（图3h）。与未接受治疗的小鼠相比，VHH-mutIL-2治疗虽然仅能轻微改善初始反应（图3f），但能显著延长小鼠的生存期（图3g）。治疗组（图3c）并未在血液中诱导显著的CAR T细胞扩增（图3d），也没有导致循环中记忆CAR T细胞的形成（图3e）。尽管分析时间比接受CAR-E治疗的小鼠群早近2周（第41天与第56天相比），但在接受VHH-mutIL-2治疗的小鼠的脾脏或骨髓中几乎检测不到CAR T细胞。几乎两个月的时间里，在接受CAR T细胞治疗的小鼠的脾脏和骨髓中，观察到了具有多种记忆表型的CAR T细胞的证据（图3f,g,i,j），这些结果强调了BCMA-mutIL-2 CAR-E治疗在增强CAR T细胞清除肿瘤细胞方面的有效性，并强调了其在生成长期持久记忆细胞方面的潜力。

图3 低剂量BCMA CAR-E与CAR-T细胞治疗

接下来，作者研究CAR- T细胞注射后2周开始的较低频率的BCMA CAR- E治疗的疗效，如图4a所示。治疗组在第14、18、21和28天接受4次CAR-E治疗（每剂4 mg kg）（图4a）。生物发光成像（BLI）分析表明，所有接受CAR-E治疗的小鼠（n =5）均清除了肿瘤，而对照组小鼠（n = 4）均未实现肿瘤清除（图4b-d）。血液分析发现，四次CAR-E治疗足以在所有接受治疗的小鼠体内强有力地扩增CAR T细胞， CAR-E治疗组的细胞因子水平升高（图4f）。尽管如此，所有小鼠的信号明显低于对照组未接受治疗的小鼠，在第83天时所有小鼠成功清除了肝转移瘤（图4b）。尽管小鼠显示了肝部信号，但没有显示骨髓信号，这表明骨髓中存在功能性记忆CAR T细胞。BCMA CAR-E细胞在体内表现出了强效的扩增。第90天的流式细胞术分析显示，存在具有不同记忆表型的CAR T细胞（图4g）。这些结果表明，BCMA CAR-E不仅能够促进完全清除肿瘤细胞，还能促进形成具有功能的记忆CAR T细胞。

图4 低剂量BCMA CAR-E控制肿瘤生长

作者在前文中发现了CAR-E和CAR-T可以完全清除肿瘤细胞，假设 CAR-E 的作用机制独立于肿瘤细胞，为了检验这一结论，在无肿瘤细胞的情况下，仅向小鼠体内注射 2.5×106个 BCMA CAR T 细胞。另外，为了同时评估 CAR-E 的影响是否具有剂量依赖性，让不同鼠接受不同剂量的 BCMA-mutIL-2 CAR-E 治疗（图 5a）。一个月后，发现CAR-E治疗导致脾脏和骨髓中CAR T细胞的扩增和持续存在。此外，CAR-E对CAR T细胞的影响与剂量有关（图5b、c）。即使在最低测试剂量2 mg/kg时，与未治疗组相比仍有的持续存在的CAR T细胞（图5b、c）。进一步的分析表明，CAR-E诱导产生了记忆CAR T细胞（图5d、e）。

为了确认低亲和力IL-2成分在CAR-E中的关键作用将剂量设为4 mg/kg，CAR T细胞数量设为200万个。小鼠接受BCMA-mutIL-2 CAR-E治疗、BCMA-CH3分子或不治疗。仅抗原的BCMA-CH3治疗组未导致CAR T细胞的扩增或持续存在，进一步验证了CAR-E中BCMA和低亲和力IL-2成分对于其对CAR T细胞的影响都是必要的（图5f、5g）。这些发现表明，CAR-E可以扩增CAR T细胞并促进产生多种记忆表型，无论肿瘤细胞是否存在。CAR-E中的BCMA和低亲和力IL-2成分对于其有效性都是必需的。

图5 低剂量BCMA CAR-E剂量依赖的方式扩增CAR-T细胞

在这一部分，作者进一步探究了CAR-E和CAR-T的转录组学变化和信号传导机制。首先作者探究了CAR-E对CAR T细胞的作用是否仅通过BCMA-CAR结合将低亲和力IL-2锚定到CAR T细胞上，还是同时涉及IL-2R和CAR内在结构域的相互作用。发现低亲和力IL-2的作用在两种CAR构件中相似，并通过抗原-CAR结合而介导。CAR-E在全CAR T细胞中显示出强效激活（如CD69表达升高和IFNγ和肿瘤坏死因子-α（TNFα）产量增加），但其对使用CAR-ICD-Δ构件的CAR T细胞的影响微乎其微（图6b-d）。蛋白激酶Lck抑制剂达沙替尼和Janus激酶抑制剂鲁索替尼，单独或联合使用，显著抑制了CAR-E的影响（图6e-g）进一步表明，CAR-E同时与CAR和IL-2R的内域结合。但它并没有导致CAR-ICD-Δ T细胞的扩增或持续存在（图6i）。通过对CAR T细胞转录组的影响的研究，细胞进行大规模RNA测序。发现CAR-E引发了显著的转录组学变化，与所有其他条件相比，其定量上的变化幅度更大（图6j-n）。这些发现表明，CAR-E的作用机制不仅限于向CAR T细胞传递低亲和力IL-2。相反，它通过同时激活CAR内域和IL-2R分子起作用。

图6 BCMA CAR-E诱导转录组学变化以及CAR和IL-2R的信号传导

CAR 增强子提高 CAR-T 细胞的活性和持久性。通过实验发现该增强子可增强 CAR 基因的表达，从而使 CAR-T 细胞在抗肿瘤活性方面表现更出色，并且在体内的持续时间更长。这一发现为优化 CAR-T 细胞疗法提供了新途径，有望改善癌症治疗效果，为患者带来更好的治疗前景。