《Cancer》杂志揭示三阴性乳腺癌的新治疗靶点SF3A2

由于缺乏有效的治疗靶点，三阴性乳腺癌（TNBC）是最致命的乳腺癌亚型。剪接因子SF3A2在TNBC组织中显著上调，并促进TNBC的进展。机理研究发现，E3泛素蛋白连接酶UBR5 促进泛素依赖性SF3A2的降解，而SF3A2又反过来调节 UBR5，从而形成一个反馈回路，平衡这两种促癌蛋白。此外，SF3A2至少部分地通过特异性调节MKRN1的可变剪接，即促进致癌异构体MKRN1-T1的表达，来促进TNBC的进展。此外，SF3A2还参与了外源性和内源性细胞凋亡的调控，从而导致TNBC细胞对顺铂产生耐药性。总之，这些发现揭示了SF3A2在TNBC进展和顺铂耐药中的未知作用，有望为治疗TNBC提供新的潜在治疗靶点。

为了鉴定促进TNBC进展的潜在靶点，作者分析了136个剪接因子的表达水平。84个剪接因子蛋白水平表达失调，64个剪接因子mRNA水平失调。其中有48个剪接因子在蛋白水平和mRNA水平均失调。根据筛选列表的排名，作者选择了SF3A2来进一步探究。

为了探索SF3A2在三阴性乳腺癌细胞的生物学功能，作者检测了正常乳腺上皮细胞系MCF10A和其他10个代表性的乳腺癌细胞系中SF3A2的蛋白表达水平。基于SF3A2在这些细胞中的表达，作者分别在MDA-MB-231和SUM159PT细胞上敲低SF3A2。细胞功能学实验表明，SF3A2 敲低抑制TNBC细胞的增殖，侵袭和迁移能力。为进一步验证，设计了靶向SF3A2的UTR的shRNA序列，回补SF3A2能逆转SF3A2敲低所导致的细胞增殖、侵袭和转移能力下降。而在正常的乳腺癌细胞系中则没有明显表型。

为探索SF3A2潜在的调节机制，在293T上过表达带Flag标签的载体，对IP产物进行质谱鉴定来寻找SF3A2相互作用蛋白。在这些相互作用蛋白中E3泛素化蛋白连接酶UBR5被选择来进行进一步验证。SF3A2和UBR5的互作进一步在MDA-MB-231和Hs578T细胞中验证。IF表明SF3A2部分与IBR5共定位。综上，SF3A2与UBR5存在相互作用关系。

由于UBR5是E3泛素连接酶，作者假设UBR5可能是SF3A2的上游调控子。已有报道表明UBR5的C端HECT结构域对其E3连接活性至关重要，HECT的C2768A突变导致催化失活。作者通过构建UBR5-C WT及UBR5-C Mut(C2768A)质粒，发现UBR5-C WT能降低SF3A2蛋白水平，而UBR5-C Mut(C2768A)则不能。体内泛素化实验表明UBR5-C WT而非UBR5-C Mut(C2768A)能够增强SF3A2的泛素化水平。综上实验证明，UBR5作为SF3A2的 泛素连接酶能够调控SF3A2的稳定性。

SF3A2是U2复合体的核心组分，IP实验证实了SF3A2与U2 snRNP复合体组分的相互作用。但是SF3A2缺失并不影响这些蛋白（SF3B1, SF3B2, SF3B3）的表达，说明SF3A2并不影响U2复合物的稳定性。作为一个剪接因子，SF3A2可能通过调节AS继而影响肿瘤进展。作者用SF3A2敲减及对照的MDA-MB-231细胞进行RNA-seq，并通过RT-PCR验证了部分结果。KEGG和GO分析表明SF3A2调节的可变剪接事件主要涉及蛋白泛素化、细胞周期、细胞分裂、细胞损伤。

由于泛素化通路在GO和KEGG中排分第一，作者选择了一个经典的E3泛素连接酶MKRN1来进行进一步探究。SF3A2缺失时MKRN1的5号外显子通过A5SS差异保留。MKRN1通过A5SS 产生了两种主要的异构体：全长MKRN1（MKRN1-T1）和截短MKRN1（MKRN1-T2）。MKRN1-T1的第5号外显子较短，编码含有482个氨基酸的蛋白质，而MKRN1-T2的第5号外显子较长，编码含有329个氨基酸的蛋白质。minigene报告基因实验表明，SF3A2 缺失显著抑制短的exon 5的保留。此外，RT-qPCR显示，SF3A2缺失导致MKRNA1-T1的mRNA水平下降，相应的MKRN1-T2的mRNA水平则上升，在SF3A2缺失后，MKRN1-T1的蛋白水平下降，而通过重新表达SF3A2则可以恢复。综上表明，SF3A2可调控MKRN1的可变剪接转换。

为了探索SF3A2在TNBC细胞中发挥其促肿瘤作用是否是通过调节MKRN1的可变剪接，作者在MDA-MB-231和SUM159PT细胞中敲低SF3A2，然后分别过表达MKRN1-T1和MKRN1-T2，使用这些稳定细胞系进行的功能测试表明，恢复MKRN1-T1（而非MKRN1-T2）可有效逆转SF3A2敲减对TNBC细胞生长和转移的影响。并进一步在体内进行验证。此外，用肺转移LM2-4175细胞系研究裸鼠的自发性肺转移。肺转移的发生率表明，SF3A2的耗竭会明显降低LM2-4175细胞的转移能力，而MKRN1-T1的恢复则可逆转这种能力。结果表明，SF3A2至少在一定程度上促进了TNBC的进展、通过改变MKRN1的剪接模式并促进MKRN1-T1的表达。

已有报道表明MKRN1通过泛素依赖的FADD降解从而调节DR介导的外源性凋亡。实验表明，SF3A2缺失导致FADD蛋白水平显著上升，促进TNBC细胞的凋亡。同时也探究了MKRN1不同异构体对FADD的调节作用。这些数据揭示了SF3A2-MKRN1-FADD通路在TNBC细胞外源性凋亡中的调节作用。

顺铂药物广泛用于TNBC患者，能促进细胞的凋亡。但耐药性的产生限制了顺铂的临床应用。作者进一步探索SF3A2对TNBC细胞顺铂耐药的影响。体内外实验表明，SF3A2是TNBC细胞产生顺铂耐药性的原因之一。