山东第一医科大学第一附属医院李杰/王新/董锋林研究团队发现外泌体circUPF2 通过降低铁死亡敏感性来增强肝癌的索拉非尼耐药性

索拉非尼是FDA 批准的首个针对晚期 HCC 的靶向治疗药物，然而由于其耐药性，索拉非尼疗效受到很大限制。相关研究表明，外泌体和环状 RNA 在癌症的恶性进展中起着至关重要的作用。然而，外泌体环状 RNA 对索拉非尼耐药性的影响仍不确定。

山东第一医科大学第一附属医院李杰/王新/董锋林研究团队在Journal of Nanobiotechnology上发表题为“Exosome-derived circUPF2 enhances resistance to targeted therapy by redeploying ferroptosis sensitivity in hepatocellular carcinoma”的文章。发现外泌体 circUPF2 促进了肝细胞癌对索拉非尼的耐药性。外泌体 circUPF2 可以充当分子支架来募集 IGF2BP2 并增强下游靶标 SLC7A11 mRNA 的稳定性。外泌体 circUPF2 促进 SLC7A11 表达并增强 HCC 细胞中System Xc- 功能，导致对铁死亡的敏感性降低和对索拉非尼的耐药性增强。外泌体 circUPF2 有可能成为一个新的肝癌治疗靶点。

为了探究外泌体在肝癌索拉非尼耐药性中的作用，建立了索拉非尼耐药细胞株（Huh-7-SR）（图 1 A）。Huh-7/Hep3B通过与Huh-7-SR共培养，能够获得索拉非尼耐药性，而 GW4869 则逆转了这一趋势（图 1B-D）。表明外泌体在肝癌细胞癌索拉非尼耐药性的形成过程中起着关键作用。

为了研究外泌体介导的索拉非尼耐药性的产生过程，分离并鉴定了Huh-7-SR 细胞（Exo-SR）和 Huh-7 细胞（Exo-Norm）的外泌体（图 1E-G）。将PKH67 标记的外泌体加入 Hep3B 和 Huh-7细胞培养基中进行培养，均检测到 PKH67 荧光信号，表明外泌体被 HCC 细胞吸收（图 1H）。接下来，将 Huh-7 和 Hep3B 细胞与Exo-SR 或 Exo-Norm 在含有 6 µM 索拉非尼的培养基中共培养，实验结果证实Exo-SR 可以诱导 HCC 细胞产生索拉非尼耐药性（图 1I-J）。

图 1 索拉非尼耐药细胞株的外泌体可诱导肝癌细胞对索拉非尼的耐药性增强

对与 Exo-SR 和 Exo-Norm 共培养的 Huh-7进行表达谱分析，以筛选潜在的信号通路。通过 GSEA 分析发现了索拉非尼抑制 HCC 进展的3条信号通路（铁死亡、ErbB 和 MAPK），铁死亡可能是外泌体诱导的 HCC 索拉非尼耐药机制中所必需的信号通路（图 2 A）。

已知脂质过氧化积累是铁死亡的关键事件，这与细胞内亚铁 (Fe ²⁺ ) 的积累密切相关，并受到细胞内 GSH 的负向修饰。Exo-SR能够逆转索拉非尼引起的HCC细胞中脂质 ROS和 Fe ²⁺ 水平升高，并上调细胞内 GSH 含量 (图 2B-D )，表明 Exo-SR 通过抑制 HCC 细胞中的铁死亡来诱导索拉非尼耐药性。

持续观察到索拉非尼治疗的 HCC 细胞中线粒体形态的改变 (肿胀、嵴迷失方向和断裂)。然而，在Exo-SR共培养组中，线粒体的超微结构形态有所改善（图 2 E）。JC-1染色表明Exo-SR可以抑制索拉非尼诱导的JC-1单体并有助于维持线粒体膜电位（MMP）（图 2F)。此外，Exo-SR 有效逆转了索拉非尼对 HCC 细胞增殖的抑制作用（图 2 G）。

图 2 Exo-SR 使 HCC 细胞对索拉非尼介导的铁死亡脱敏

通过表达谱筛选在Exo-SR 共培养 HCC 细胞中与铁死亡相关的差异表达基因，其中SLC7A11的表达显著升高，且SLC7A11高表达的患者的OS和DFS较差（图 3 A-E）。SLC7A11 是 System Xc- 的主要功能基序，通过摄取胱氨酸来调节 GSH 合成。与 Exo-SR 共培养的细胞表现出更高的胱氨酸摄取能力，Exo-SR 也诱导了HCC 细胞中的脂质 ROS 水平降低（图 3F和G）。接下来，使用 si-SLC7A11 抑制 HCC 细胞中的 SLC7A11 表达，发现抑制HCC细胞中SLC7A11的表达将使Exo-SR失去抑制铁死亡的作用（图 3H和J）。这些发现表明：Exo-SR通过促进SLC7A11表达和维持System Xc- 功能来保护HCC细胞免于铁死亡。

图 3 Exo-SR 通过促进 HCC 细胞中 SLC7A11 的表达来抑制铁死亡

对Exo-SR和Exo-Norm进行circRNA表达谱分析，共鉴定出88,689个环状RNA。筛选到259个显着上调和1610个显着下调的circRNAs，7个circRNAs在 Exo-SR 中表现出最显著的上调表达（图 4 A-C）。

为了证实circRNA 参与抑制外泌体诱导的铁死亡，开发了专门针对circRNA 剪接序列的 siRNA 并将其转染到 Huh-7-SR 细胞中，转染 48 小时后，分离外泌体（Exo-SR ^si−ciR），然后与 HCC 细胞共培养。Exo-SR 中 hsa_circ_0017702 抑制完全消除了其增强 HCC中 SLC7A11 表达的能力（图 4 D和E），消除了其维持System Xc-的功能（图 4 F）和降低 HCC 细胞中脂质 ROS 水平的作用（图 4 F和G）。

此外，通过qRT-PCR评估了患者血液外泌体中 hsa_circ_0017702的表达情况，PD患者中hsa_circ_0017702的表达明显升高，表明外泌体可能在 HCC 患者中传播 hsa_circ_0017702（图 4 H）。这些表明，hsa_circ_0017702 可能在外泌体诱导的 HCC索拉非尼耐药性过程中起着关键作用。

图 4 外泌体 hsa_circ_0017702调节受体细胞SLC7A11 的表达

根据 circBase，hsa_circ_0017702 (circUPF2) 是一个环状 RNA，源自 chr10 的 UPF2 基因 (图 5 A)。在 Huh-7-SR 细胞中，circUPF2 的表达显著上调，而 Exo-SR 显著提高了常规 HCC 细胞中的 circUPF2 表达 (图 5 B)。circUPF2 对 RNase R 表现出更高的抗性 (图 5 C)。circUPF2 表现出更高的稳定性（图 5D）。这些结果表明 circUPF2 是一种稳定的环状转录本，可以通过 Exo-SR 有效地运输到常规 HCC 细胞中。

使用 siRNA抑制 circUPF2 的表达，circUPF2 的抑制有效抵消了 Huh-7-SR 细胞中的索拉非尼耐药性，然而对 circUPF2 表达较低的 Huh-7 细胞没有显著影响 (图 5 F)。表明 circUPF2 在索拉非尼耐药性中起着至关重要的作用。随后开发了 circUPF2 (OE-ciR) 的过表达载体，并证实它可以有效增加 Huh-7 和 Hep3B 细胞中 circUPF2 的表达，而不会干扰其线性对应物的表达 (图 5 G)。过表达 circUPF2的细胞对索拉非尼的耐药性显著增加，铁死亡受到抑制，胱氨酸摄取能力提升，线粒体活性增强（图 5 H-M）。

考虑到SLC7A11是Exo-SR的主要调控焦点，因此还研究了circUPF2和SLC7A11的表达关联。Spearman相关性分析证实了HCC肿瘤组织中circUPF2和SLC7A11表达存在正相关性（P  <0.001，R ²  = 0.69）（图 5 N）。FISH 证实了circUPF2和SLC7A11在胞浆中共定位，提示两者可能存在相互作用 (图 5 O)。在肝癌细胞中过表达 circUPF2 可上调 SLC7A11 表达 (图 5 P 和 Q)。这些结果表明 Exo-SR circUPF2通过增强 SLC7A11 表达、抑制肝癌细胞铁死亡来发挥重要作用。

图 5 circUPF2在抑制索拉非尼介导的铁死亡中的重要作用

为了研究circUPF2调控铁死亡的分子机制和筛选circUPF2相互作用蛋白，进行了RNA pull-down和质谱分析(图 6A )。发现IGF2BP2是circUPF2的结合蛋白，据报道它对调节mRNA稳定性至关重要 (图 6B和C )。此外，IF-FISH 证实了 IGF2BP2 和外泌体 circUPF2 的细胞质共定位。

基于 RBPsuit 数据库进行预测，发现circUPF2的GCAAACA 基序 (1269-1275 nt) 和 GAAUACA 基序 (1771-1777 nt) 是 IGF2BP2 的假定结合基序 (图 6 E)。通过EMSA证实了 circUPF2的 GAAUACA 基序对于与 IGF2BP2 的相互作用至关重要，GAAUACA 基序突变后，circUPF2-IGF2BP2 复合物显著减少（图 6 E）。随后，探索了能够与 circUPF2 相互作用的 IGF2BP2 特定结构域。实验表明双结构域 KH3-4 负责 IGF2BP2 与 circUPF2 的结合（图 6 F）。总之，这些发现表明 circUPF2 充当框架，通过GAAUACA 基序与 IGF2BP2 的 KH3-4 双结构域结合来触发 circUPF2-IGF2BP2 复合物的形成。

图6 CircUPF2 作为支架复合物与 IGF2BP2相互作用

BLAST分析发现circUPF2的CAAAAG基序可以与SLC7A11的3′-UTR（GUUUUC基序）结合，同时也证实了circUPF2与SLC7A11 mRNA的相互作用（图 7 A-C）。IF-FISH表明 SLC7A11 和 IGF2BP2 在细胞质中共定位（图 7 D）。

为了进一步证实 circUPF2-IGF2BP2复合物形成对稳定 SLC7A11的必要性，在 HCC 细胞中同时进行了 circUPF2 过表达和 IGF2BP2 表达抑制。OE-circUPF2上调了 SLC7A11的表达，但 si-IGF2BP2 则逆转了这一变化（图 7 E和F）。ActD 分析表明，当 circUPF2 过表达时，SLC7A11 的 mRNA 稳定性显著增强，而这需要 IGF2BP2 的存在（图 7 G）。此外，观察到si-IGF2BP2逆转了OE-ciR对HCC细胞铁死亡的抑制作用（图 7 H和I），这与SLC7A11的表达变化一致。这些发现表明circUPF2促进了IGF2BP2与SLC7A11之间的相互作用，通过形成circUPF2-IGF2BP2-SLC7A11三元复合物提高SLC7A11 mRNA的稳定性。

图7 CircUPF2-IGF2BP2复合物稳定 SLC7A11的表达

为了探究外泌体circUPF2在体内的作用，建立了异种移植瘤模型。体内荧光成像显示DiR标记的外泌体在异种移植瘤内大量聚集（图 8A）。索拉非尼+Exo-SR组肿瘤生长速度更快，重量更大，表明索拉非尼的疗效有限。然而，当抑制 Exo-SR（Exo-SR ^si−ciR ）中 circUPF2 的表达时，肿瘤组织恢复了对索拉非尼的敏感性，表现为肿瘤生长速度降低和重量减轻（图 8 B）。Exo-SR 显着抑制索拉非尼治疗的 HCC 肿瘤中的细胞凋亡，而当 Exo-SR 中的 circUPF2 表达受到抑制时，这种影响发生逆转（图 8 C）。相同的结果也反映在肿瘤增殖能力上（图 8 D）。

随后，在肿瘤组织中检测 circUPF2 和 SLC7A11 的表达。Exo-SR组 (G3) 的 circUPF2和SLC7A11的表达显著升高，但在注射敲低 circUPF2 的外泌体后没有显著升高(图 8 E-H)。综合表明Exo-SR通过递送circUPF2促进SLC7A11表达并增强HCC对索拉非尼的体内耐药性。

图8通过递送 circUPF2 显著增强了肝细胞癌对索拉非尼的体内耐药性

原文链接：

https://jnanobiotechnology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12951-024-02582-6